Биостимуляция хряща коленного сустава с использованием аутологичных микро-трансплантатов: предварительное исследование протокола Rigenera при остеохондральных поражениях колена

Агустин Дорта Фернандез, Ана Барони Луенго Отделение хирургии рук и микрохирургии, Ла Лагуна, Испания Отделение компьютерной науки и технологии, Международный Университет Ля Риохи, Ля Риоха, Испания

Аннотация: Остеохондральные патологии связаны с потерей хряща. Аутологичные микрографы, полученные из различных тканей, содержащих мезенхимальные стволовые клетки, доказали регенеративные свойства в различных тканях. Исследование включало пациентов с остеохондральной патологией, которые не реагировали на обычные методы лечения и считались пригодными для лечения аутологичным микрографом. За 15 дней до вмешательства пациенты начали лечение хондроитинсульфатом и дополнительным витамином С и цинком. Аутологичные микрографы были получены из кожи уха и хряща, дезагрегированных с использованием системы Rigenera и вводимых в колено под местной анестезией. После вмешательства пациенты прошли шестинедельную реабилитационную программу, основанную на упражнениях, без использования дополнительного веса. Девять пациентов были включены в исследование. Аутологичный перенос трансплантата был успешным у всех пациентов, и никаких серьезных осложнений не было, включая эстетические дефекты на донорском участке. Восемь пациентов (88,9%) наблюдали улучшение во всех субдоменах шкалы WOMAC. Среднее (IR) улучшение в шкале WOMAC составило 22,0 (10,0 - 40,0) балла. Обследование МРТ показало отсутствие объемных поражений в колене и окружающих мягких тканей у всех пациентов. Снижение отека наблюдалось у 8 из 9 пациентов (88,9%); 3 пациента (33,3%) показали утолщение хрящевой линии. Аутологичный перенос микро-трансплантата с использованием системы Rigenera является безопасным и имеет многообещающие результаты в лечении хондральных травм, связанных с ограничением функциональности и болью.

Ключевые слова: Rigenera, остеоартрит, остеохондральные области, мезенхимальные стволовые клетки, регенерация тканей
1. ВСТПУЛЕНИЕ.
Остеохондральные патологии могут возникать в результате травм или спортивных травм или быть следствием расстройств, связанных с дегенерацией хряща, таких как хондромаляция и остеоартрит. Независимо от этиологии остеохондральной патологии, потеря хряща, проявляющаяся в магнитно-резонансных изображениях (МРТ), как истончение линии хряща, вызывает боль и физическую нетрудоспособность. В дополнение к хирургии, традиционное лечение дегенеративных заболеваний хряща основано на физической терапии и облегчении боли. Однако некоторые пациенты плохо реагируют на болеутоляющие средства, а регенерация поврежденного хряща может длиться долгое время, что ставит под угрозу полное функциональное восстановление.
В последние годы были предприняты многочисленные усилия по разработке дополнительных стратегий, направленных на либо восстановление поврежденного хряща, либо улучшение процесса естественного возобновления. В дополнение к внутрисуставному использованию гиалуроновой кислоты были предложены различные подходы к стимуляции производства нового хряща. Методы биостимуляции включают физические подходы, такие как использование высокочастотной биостимуляции во время операции или маломощный лазер, нацеленный на остеохондральный дефект, и биологические подходы, такие как аутологичная имплантация хондроцитов и использование богатой тромбоцитами плазмы для стимулирования производства нового хряща.
Обнаружение стволоподобных популяций клеток с мультипотентными признаками в различных тканях мотивировало использование этих клеток в регенеративных целях. Однако наличие готовых к использованию методов для обеспечения безопасности и эффективной изоляции мезенхимальных стволовых клеток во время операции было затруднительным для клинического использования мультипотентных клеток. Протокол Rigenera представляет собой новую стратегию дезагрегации тканей, которая позволяет получать аутологичные микрографы, обогащенные мезенхимальными стволовыми клетками во время операции. По сравнению с ферментативными методами, механическая дезагрегация показывает, что она быстрее и безопаснее. На сегодняшний день протокол Rigenera показал клиническую эффективность в лечении сложных ран и регенерации зубной пульпы в периодонтальных операциях (генерация периодонтальной ткани). Однако идентификация стволоподобных клеток во многих других тканях предполагает дополнительное использование подготовки и переноса аутологичных микрографов. В этом предварительном исследовании описаны клинические и функциональные результаты аутологичной микрографитации хряща (полученные по протоколу Rigenera) у пациентов с остеоартикулярным проявлением повреждением хряща или дегенерацией коленного сустава.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Предметы исследования
В этом проспективном исследовании были включены пациенты с механической и/или дегенеративной остеохондральной патологией, которые не реагировали на обычные методы лечения и считались пригодными для лечения аутологичными микрографами в экспериментальной обстановке. Пациенты были выбраны и лечены одним и тем же хирургом в период с января 2016 года по апрель 2016 года.
В дополнение к полному анализу крови и скорости оседания эритроцитов все пациенты были подвергнуты скринингу на заболевания иммунной системы и нарушения обмена веществ, включая витамины D3 и B12, триглицериды, холестерин, гликированный гемоглобин и уровни гормонов щитовидной железы. У мужчин также оценивались уровень тестостерона. Пациенты с иммунными или воспалительными заболеваниями, такими как наследственный остеоартрит, история ревматических воспалительных заболеваний и те, у кого положительный тест на антинуклеарные антитела, наличие ревматоидного фактора и антистрептолизина O, превышающие 150, были исключены. Пациенты с ожирением, сахарным диабетом и другими заболеваниями обмена веществ, включая тех, которых лечили статинами и/или гиполипидемическими агентами, также были исключены. Все пациенты подписали информированное согласие на проведение экспериментальной процедуры.
2.2. Автоматический перенос микро-трансплантатов
За 15 дней до вмешательства пациенты начали лечение хондроитинсульфатом и дополнительным витамином С и цинком. Пациенты с низким уровнем витамина D3 и B12 также прошли лечение этими витаминами. Нестероидные противовоспалительные препараты не допускались для приема в течение 15 дней, предшествующих вмешательству. За шесть часов до вмешательства пациенты начали лечение азитромицином 500 мг (поддерживалось в течение двух дней после вмешательства) и голодали до вмешательства.
Хрящный трансплантат был получен из хряща ушной раковины ипсилатерального уха для колена, которое подвергалось лечению, с использованием объектива Цейса размером x3,5 в стерильном файле. Чтобы обнажить хрящ ушной раковины, был выделен кожный трансплантат в форме глаза размером 2 х 1,2 см (приблизительно 120 мм2). Хрящевой трансплантат вырезали скальпелем (№ 11) и ножницами для микрохирургии. Перихондриальная ткань, окружающая хрящевую щель, была поцарапана и добавлена к образцу. Рану промывали 1: 1 раствором 3% перекиси водорода и физиологическим раствором, и швы обрабатывали подкожного с помощью викрила 6/0 и поперечных стежков 2-к-3.
Приблизительно 0,1 см3 дермы и подкожной ткани отделили от кожного трансплантата и смешали с 0,25 до 0,3 см3 хряща ушной раковины и перихондриальной ткани. Образец был механически дезагрегирован по протоколу Rigenera согласно спецификациям производителя в течение двух циклов в 2 минуты, получив клеточный трансплантат 4 см3. Конечное количество полученных клеток не определялось. Однако, согласно предыдущему опыту с системой Rigenera, носовой хрящ дал 9088,30 ± 788,86 хондроцитов на мл переработанной ткани; следовательно, ожидается, что образец получит 2 - 3 × 103 хондральных клеток. Аналогично, фенотип дермальных клеток, полученных с использованием системы Rigenera, был ранее проанализирован Сволаккиа и др., который обнаружил следующие проценты маркеров мезенхимальных стволовых клеток: 82% CD34, 82% CD90 (Thy-1) и 53% CD105 [23]. Авторы сообщили о выходе 80х103 клеток - 70-80% из них мезенхимальных - с 92% жизнеспособности от 2 мм3 дермальной ткани. Учитывая, что дермальный образец составлял приблизительно 120 мм3 (поверхность 120 мм2 и толщина 1 мм), чтобы ожидаемо получить почти 4,8×105 клеток. Дезагрегированные клетки были окончательно введены в колено с помощью инъекции надколенника под местной анестезией. Пассивное движение колена применялось для равномерного распределения образца внутри колена.

2.3. Протокол реабилитации и оценки
Полный перенос веса без какого-либо ортеза был разрешен через шесть недель после вмешательства. В течение этого периода пациентам было рекомендовано выполнять упражнения, без задействия веса, с участием подколенного сухожилия и четырехглавой мышцы, а также стационарный велосипед без сопротивления. После заживления раны на ухе, пациенты могли плавать. Нормальная походка была достигнута за счет введения прогрессивного веса в течение шести дополнительных недель. Пациентам не разрешалось принимать нестероидные противовоспалительные препараты во время всего наблюдения.
Прогресс остеохондрального повреждения оценивали с помощью МРТ-тестов, которые проводились до и через 12 недель после вмешательства. Функциональные и болевые оценки проводились с использованием шкалы WOMAC (испанская версия). Данные представлены как необработанные, а как медианный и межквартильный диапазон (IR, соответствующий процентилям 25 и 75) или среднее и стандартное отклонение (SD).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Пациенты и процедура
Передача аутологичного трансплантата выполнялась у девяти пациентов, соответствующих всем критериям отбора. Средний возраст (SD) составлял 51,7 (6,2), 56% мужчин, и ни один из них не был активным курильщиком. Во всех случаях процедура была успешной, и ни у кого из них не наблюдались инфекции или серьезных осложнений после процедуры. У двух пациентов наблюдался внутрисуставной выпот, проявившийся через несколько дней после процедуры. Никаких эстетических дефектов на донорском участке у любого пациента не наблюдалось, и никто из них не жаловался на результат на донорском участке. У одного пациента с историей кровоизлияний в детстве возникли ретроурикулярные кровоподтеки, которые зажили без других вмешательств, кроме добавок витамина К и не оставили эстетического дефекта.
3.2. Симптомы и функциональный результат
За исключением одного пациента, у которого наблюдался отек, связанный с проникновением клеток, все пациенты отмечали значительное уменьшение боли в течение нескольких дней после процедуры. В конце наблюдения всех пациентов все пациенты возвращались к своей деятельности, выполнявшейся до ухудшения состояния хряща. В таблице 1 показаны детали функциональной и болевой оценки в начале исследования и в конце наблюдения. Восемь пациентов (88,9%) наблюдали улучшение во всех субдоменах шкалы WOMAC. Средний (IR) общий показатель WOMAC у исследуемых составлял 39,0 (19,5 - 59,0) до вмешательства и 9 (3,0 - 23,5), медианное улучшение - 22,0 (10,0 - 40,0) пункта. Пациентка 3 улучшила ее гибкость и функциональные нарушения, но обострила боль, связанную с состоянием коленного сустава. В целом, средняя (IR) боль, гибкость и улучшение функции составляли 5,0 (3,3 - 9,0) по 20-балльной шкале, 3,0 (1,3 - 3,8) по 8-балльной шкале и 19,5 (9,3 - 30,0) на 68-балльной шкале соответственно.
МРТ-исследование выявило отсутствие пространственно-занимающих поражений в колене и окружающих мягких тканях у всех пациентов. Снижение отека наблюдалось у 8 из 9 пациентов (88,9%) (рис. 1А). У женщины в случае 9 наблюдалось больше отеков в послеоперационном вмешательстве, чем при МРТ до вмешательства. Хондромаляция показала частичную регрессию в 5 из 7 случаев (71,4%), в которой сообщалось о хододромных признаках. У трех пациентов (33,3%) наблюдалось утолщение хрящевой линии (рис. 1B). Из 8 пациентов с видимым разрывом хряща на исходном уровне, у 4 сохранилась травма, 1 показал значительное улучшение, и 2 не показали никаких признаков травмы на МРТ после вмешательства. У трех пациентов была обнаружена киста Бейкера на исходном исследовании: у одного она осталась неизменной, у еще одного уменьшился размер кисты, и у еще одного не было видимых кист при МРТ после вмешательства. У пациента, у которого наблюдалось ухудшение гибкости колена, была травма хряща до процедуры, которая сохранилась после процедуры.

Подписи к рисункам

Рисунок 1. Основные результаты МРТ до и после процедуры. A: случай 4 на презентации (слева) и шестнадцать недель после (справа); изображения показывают уменьшение отека и увеличение определения линии хряща. B: случай 7 на презентации (слева) и двенадцать недель после вмешательства (справа); толщина хряща увеличилась на 2,78 см. C: случай 1 при представлении (слева) и 17 недель после; киста Пекара длиной 36 мм х 16 мм в ширину, идентифицированная при представлении, показала полную ремиссию через 17 недель после процедуры.
Таблица 1. Характеристики пациента и результаты шкалы WOMAC.

WOMAC оценивает * боль | гибкость | ограничение функции

№ Пациента

Пол

Возраст

До вмешательства

После вмешательства

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Мужчина

Мужчина

Женщина

Мужчина

Мужчина

Мужчина

Женщина

Женщина

Женщина

44

44

54

63

50

48

56

56

50

4|1|8

2|3|4

3|5|19

11|5|45

7|2|30

12|6|29

18|8|63

12|5|40

6|3|17

0|0|0

0|0|2

7|2|15

6|2|18

4|2|17

3|2|4

1|2|4

3|3|9

1|0|3


• Диапазоны баллов для оценки боли, гибкость и функционального ограничения составляют 0-20, 0-8 и 0-68 соответственно.
4. ОБСУЖДЕНИЕ
Мы представляем здесь 9 случаев пациентов с травмами хряща, которые испытывали улучшение болевого синдрома и функциональности - некоторые из них с изменениями, видимыми при МРТ, - после внутрисуставной инъекции аутологичного микрографа, полученного по протоколу Rigenera. Хрящевая травма в колене является сложным случаем для хирургической реконструкции. Несмотря на хорошие результаты, наблюдаемые при протезировании, возрастает интерес к разработке безопасных и эффективных процедур для биологической шлифовки и сохранения суставов. Обоснование протокола Rigenera заключается в мультипотентных свойствах мезенхимальных стволовых клеток, которые могут способствовать дифференцировке клеток и последующему новому образованию хряща. По нашему опыту, использование аутологичных трансплантатов, обогащенных мезенхимальными клетками, привело к заживлению или улучшению дефектов хряща, видимых при МРТ. После вмешательства с использованием трансплантата все пациенты, кроме одного, показали уменьшение отека. Однако, учитывая функциональность и улучшение болевого синдрома у этого пациента, отек после вмешательства был приписан нормальному процессу заживления. У большинства пациентов наблюдалась заметное улучшение хрящевого разрыва или уменьшение линии хряща на исходном уровне. Технические ограничения на проведение МРТ не позволили количественно оценить интересные параметры, такие как толщина хряща или размер дефектов хряща, у всех пациентов. Несмотря на это ограничение, у трех пациентов наблюдалось значительное увеличение толщины хряща (в лучшем случае от 1,03 до 4,08 см) на тестах до и после вмешательства. Стоит отметить, что у одного пациента была 36-сантиметровая киста Бейкера при базовом обследовании, что не было видно при МРТ после вмешательства, что указывает на значительное снижение воспаления.
Независимо от результатов МРТ, все пациенты, кроме одного, продемонстрировали улучшение болевого синдрома, гибкости и функциональности и вернулись к своей обычной физической активности через двенадцать недель после вмешательства. В некоторых случаях хрящевой дефект достигал серьезного ограничения функциональности, связанного с сильной болью, которая не позволяла пациентам вести свою повседневную жизнь, включая работу и нормальное перемещение. Боль и функциональность оценивались с помощью испанской версии шкалы WOMAC, которая широко используется в исследованиях и в обычной клинической практике для оценки тяжести травм колена. Результаты оценки WOMAC в исследованиях, изучающих эффективность других методов биостимуляции, неравномерны, при этом одни исследования сообщают о значительном улучшении, а другие сообщают о небольшом ухудшении через 2 или 3 месяца. Кроме того, различные схемы исследований и этиологии препятствуют надежным сопоставлениям между исследованиями. Однако, не упуская из виду эти ограничения, в исследовании пациенты проявили большую тенденцию к улучшению функциональности и болевого синдрома, чем те, которые были обработаны препаратами плазмы, обогащенными тромбоцитами (PRP), и оценивались по той же шкале. Кроме того, хотя число включенных пациентов не позволяет провести корреляционный анализ, улучшение болевого синдрома в сочетании с улучшением функциональности и гибкости, оценки WOMAC в целом согласуются с результатами МРТ, как и ожидалось, учитывая корреляцию между болью и дефектом хряща, видимым на МРТ.
Строгие критерии отбора ограничивали число пациентов, включенных в исследование. Однако, поскольку это был исследовательский тест на безопасность и эффективность протокола Rigenera в лечении состояний хряща коленного сустава, мы считали исключение иммунных и воспалительных заболеваний важным условием для достижения наилучших результатов перенесения клеток и независимо оценку безопасности. Другим важным ограничением была гетерогенность информации МРТ, которая препятствовала количественному анализу результатов МРТ. Тем не менее, оценки МРТ дали ценный вклад в физиологические эффекты биостимуляции хряща.
Таким образом, это исследование показывает, что передача аутологичных микрографов с использованием протокола Rigenera является безопасной и имеет многообещающие результаты в лечении повреждений хряща, связанных с болью и функциональным ограничением. Эти результаты свидетельствуют о пригодности дальнейших проспективных контролируемых исследований с более крупными выборками пациентов для подтверждения терапевтических свойств этого вмешательства.